Как определить последовательность ДНК

Сегодня мы часто слышим о том, что ученые расшифровали геном очередного организма, который представляет собой интерес для дальнейших экспериментов. Но как это происходит и что означает «определить последовательность ДНК»? Давайте попробуем разобраться.

Но прежде чем говорить непосредственно о процессе, определим, из чего собственно состоит наша жизненно необходимая молекула. Первичной структурой ДНК является последовательность нуклеотидов. Нуклеотид – это своеобразный «кирпичик», образованный сахаром дезоксирибозой, остатком фосфорной кислоты и азотистым основанием. Для ДНК характерно четыре вида нуклеотидов: Аденин, Гуанин, Цитозин, Тимин. В дальнейшем нуклеотиды, способные многократно повторяться, собираются в 2 противоположно направленные цепочки. Цепи скручиваются в спираль, превращаясь во всем знакомую картинку, показанную ниже (рис 1).

Рис.1. Формирование вторичной структуры ДНК

Причем азотистые основания стыкуются парами аденин-тимин, гуанин – цитозин, и никак иначе, что называется свойством комплементарности. Потом молекула начинает сворачиваться в спирали и петли, достигая уровня хромосомы, которая образуется только при делении клетки.

А теперь перейдем непосредственно к определению последовательности нуклеотидов, которая по-научному называется секвенированием. По правде существует не один метод, однако хочу рассказать о распространенной и используемой платформе Illumina.

Метод состоит из трех этапов:

1. Подготовка ДНК

2. ПЦР – копирование ДНК

3. Непосредственно секвенирование

Сначала молекулу ДНК разрезают на короткие участки, затем с противоположных сторон пришивают адаптеры - короткие последовательности нуклеотидов. Потом нити ДНК с помощью высоких температур разделяют и запускают в проточную ячейку прибора для секвенирования, там, на подложке молекулы, с помощью адаптеров прикрепляются к специальным участкам. Причем каждая цепочка крепится двумя концами, образуя мостик. В дальнейшем в ячейку вносится ДНК-полимераза – фермент, необходимый для создания копий – амплификатов. Фермент крепится к праймеру и начинает удвоение цепочки, наращивая последовательность нуклеотидов, находящихся в растворе. Таким образом, вокруг каждой одноцепочной ДНК наращиваются кластеры, которые представляют собой копии молекулы ДНК прямой и обратной цепи. В дальнейшем копии одной из цепей удаляются, чтобы от кластера шел однородный сигнал. Ну что ж, вот все готово к секвенированию. Но перед этим уточним, для чего нужны предыдущие этапы. Нарезка ДНК необходима для скорости и точности процесса, а копирование – для усиления флюоресцентного сигнала при секвенировании.

Рис 2. Этапы подготовки ДНК к секвенированию

Итак, после всех подготовок в ячейку прибора добавляются ДНК зависимая ДНК-полимераза и флюоресцентные нуклеотиды с модифицированными 3’-концами, с которыми работает фермент при создании последовательности. Теперь ДНК-полимераза присоединяет по одному нуклеотиду. Когда «кирпичик» занял свое место, цветовой сигнал фиксируется оптической частью секвенатора и создается картинка с флюоресцентными точками. Затем ячейка промывается, в неё запускается новый раствор с необходимыми компонентами, при этом с 3’-конца прикрепившегося нуклеотида химическим способом снимается радикал, мешавший дальнейшей работе фермента, который будет дальше прикреплять новый компонент будущей цепочки. Далее подобные циклы повторяются до тех пор, пока молекула не будет достроена.

Рис. 3 Процесс секвенирования по платформе Illumina

Флуоресцентные сигналы считываются с помощью лазера и фиксируются на картинке c большим разрешением bcl-файле, который впоследствии преобразуется в fastq файлы, где нуклеотидная последовательность представлена в буквенной записи «AAGTCATT….». С такими файлами уже работают дальше: определяют какая это последовательность, какой ген в ней закодирован.

Но стоит отметить, что это лишь один из методов секвенирования ДНК, возможны и другие альтернативы, например, секвенирование в реальном времени. Все они имеют плюсы и недостатки. Принцип тоже может быть несколько разным, однако преследуемая цель-определение последовательность нуклеотидов, матрицы, по которой синтезируются в организме белки, выполняющие разнообразие жизненно важных функций. Понять структуру ДНК необходимо, поскольку так откроется тайна механизмов наследственных заболеваний, нарушений метаболизма, а так же так устанавливается эволюционное родство биологических видов, что чрезвычайно важно для изучения форм жизни, обитающих на планете Земля. Секвенирование нового поколения поистине совершило революцию в биологии, позволив приоткрыть дверцу в неизведанный мир биомолекул!

#ДНК #Illumina #геном #секвенирование